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抗氧化功能评价方法

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抗氧化功能评价方法 试验项目、试验原则及结果判定

 

试验项目、试验原则及结果判定

Items, Principles and Result Assessment

 

1 试验项目

1.1 动物实验

1.1.1 体重

1.1.2 脂质氧化产物:丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素(8-Isoprostane

1.1.3 蛋白质氧化产物:蛋白质羰基

1.1.4 抗氧化酶:超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶

1.1.5 抗氧化物质:还原性谷胱甘肽

1.2 人体试食试验

1.2.1 脂质氧化产物:丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素(8-Isoprostane

1.2.2 超氧化物歧化酶

1.2.3 谷胱甘肽过氧化物酶

2 试验原则

2.1 动物实验和人体试食试验所列的指标均为必测项目。

2.2 脂质氧化产物指标中丙二醛和血清8-表氢氧异前列腺素任选其一进行指标测定,动物实验抗氧化酶指标中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶任选其一进行指标测定。

2.3 氧化损伤模型动物和老龄动物任选其一进行生化指标测定。

2.4 在进行人体试食试验时,应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。

3 结果判定

3.1 动物实验:脂质氧化产物、蛋白质氧化产物、抗氧化酶、抗氧化物质四项指标中三项阳性,可判定该受试样品抗氧化功能动物实验结果阳性。

3.2 人体试食试验:脂质氧化产物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项指标中二项阳性,且对机体健康无影响,可判定该受试样品具有抗氧化功能的作用。

 

抗氧化功能检验方法

Method for the Assessment of Antioxidative Function

 

1 动物实验

1.1 实验动物

选用10月龄以上老龄大鼠或8月龄以上老龄小鼠,也可用氧化损伤模型鼠。单一性别,小鼠每组1015只,大鼠812只。

1.2 剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组和一个溶剂对照组,以人体推荐量的10倍(小鼠)或5倍(大鼠)为其中的一个剂量组,另设两个剂量组,高剂量一般不超过30倍,必要时设阳性对照组、空白对照组。受试样品给予时间30天,必要时可延长至45天。

1.3 实验方法

1.3.1 老龄动物

选用10月龄以上大鼠或8月龄以上小鼠,按血中MDA水平分组,随机分为1个溶剂对照组和3个受试样品剂量组。3个剂量组给予不同浓度受试样品,对照组给予同体积溶剂,实验结束时处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

1.3.2  D-半乳糖氧化损伤模型

1.3.2.1原理

D-半乳糖供给过量,超常产生活性氧,打破了受控于遗传模式的活性氧产生与消除的平衡状态,引起过氧化效应。

1.3.2.2造模方法

25-30g健康成年小鼠,除空白对照组外,其余动物用D-半乳糖40mg1.2g/kg BW颈背部皮下注射或腹腔注射造模,注射量为0.1mL/10g,每日1次,连续造模6周,取血测MDA,按MDA水平分组。随机分为1个模型对照组和3个受试样品剂量组,3个剂量组经口给予不同浓度受试样品,模型对照组给予同体积溶剂,在给受试样品的同时,模型对照组和各剂量组继续给予相同剂量D-半乳糖颈背部皮下或腹腔注射,实验结束处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

1.3.3 乙醇氧化损伤模型

1.3.3.1原理

乙醇大量摄入,激活氧分子产生自由基,导致组织细胞过氧化效应及体内还原性谷胱甘肽的耗竭。

1.3.3.2造模方法

2530g健康成年小鼠(180220g大鼠),随机分为4个组,1个模型对照组和3个受试样品剂量组,必要时可增设1个空白对照组。3个剂量组给予不同浓度受试样品,模型对照组给予同体积溶剂,连续灌胃30天,末次灌胃后,模型组对照组和3个剂量组禁食16小时(过夜),然后1次性灌胃给予50%乙醇12ml/kgBW6小时后取材(空白对照组不作处理,不禁食取材),测血清或肝组织脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。

 

1.3.4脂质氧化产物测定

1.3.4.1 血中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)含量测定

血中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)含量可采用荧光法和比色法测定,方法任选其一。

1.3.4.1.1 荧光法

1.3.4.1.1.1 荧光法原理

MDAmalondiadehycle)是细胞膜脂质过氧化的终产物之一,测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛(MDA)分子与2个硫代巴比妥酸(TBA)分子在酸性条件下共热,形成粉红色复合物。以波长536nm为激发光,在550nm有最强荧光强度。可用荧光法进行微量测定。

1.3.4.1.1.2 仪器与试剂

仪器:荧光分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管

试剂:  

10mmol/L四乙氧基丙烷(贮备液,棕色瓶4℃保存12个月),临用前用纯水稀释成1nmol/mL

29mmol/L硫代巴比妥酸工作液

    硫代巴比妥酸 0.209g

    EDTA.2H20 25mg

    谷胱甘肽还原型 1mg

0.02mol/L  NaOH  50 mL 溶解微温助溶,棕色瓶4℃保存2

酸水解液

0.1mol/L H2SO4 125mL

0.1mol/L Na2SO4 125mL

加水150mL H2SO4 pH 1.5加水稀释至500mL

正丁醇

以上所用玻璃器皿均需经50%硝酸浸泡24h后,再经蒸馏水、双蒸水淋洗干燥,试剂

(选AR级)最好用双蒸水配制。

1.3.4.1.1.3 实验步骤

1.3.4.1.1.3.1 样品制备

全血上清液:取血50μl加入0.5mL生理盐水,2000r/min离心10min,取上清液待测。

血清样品:取血0.5mL室温静置10min2000r/min离心10min,取上清液待测。

1.3.4.1.1.3.2 标准曲线制作  

10nmol/mL四乙氧基丙烷,用双蒸水稀释成0.00.250.51.01.523510nmol/mL分别取0.1mL加入酸水解液 2mLTBA工作液0.5mL→混匀,避光、沸水浴60min→流水冷却至室温→3mL正丁醇振荡抽提1min3000r/min离心5min→取上清液(正丁醇层)测荧光强度(入射狭缝1.5nm,出射狭缝5nm  激发波长536nm,发射波长550nm

以四乙氧基丙烷浓度为横坐标,荧光强度为纵坐标作图。

1.3.4.1.1.3.3样品测定

 

    试剂

空白管

样本管

标准管

10mL具塞离心管

0.1mL蒸馏水

0.1mL血清*

0.1mL标准#

酸水解液

2mL

2mL

2mL

TBA工作液

0.5mL

0.5mL

0.5mL

混匀,避光沸水浴60min,流水冷却

正丁醇

3mL

3mL

3mL

振荡抽提1min3000r/min 离心5min

*全血上清液 0.5mL空白管加蒸馏水0.5mL,标准管加标准0.1mL、蒸馏水0.4mL

1nmol/mL四乙氧基丙烷标准

血清0.1mL(或全血上清液0.5mL→加入酸水解液 2mLTBA工作液0.5mL→混匀,避光、沸水浴60min→流水冷却至室温→3mL正丁醇振荡抽提1min3000r/min离心5min→取上清液(正丁醇层)测荧光强度(入射狭缝1.5nm,出射狭缝5nm  激发波长536nm,发射波长550nm

 

1.3.4.1.1.3.4 计算公式:

A:空白管荧光度

B:样品荧光度

F:四乙氧基丙烷荧光度

C:四乙氧基丙烷浓度1nmol/mL

K:稀释倍数

1.3.4.1.2比色法

1.3.4.1.2.1比色法原理

MDAmalondiadehycle)是细胞膜脂质过氧化的终产物之一,测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛(MDA)分子与2个硫代巴比妥酸(TBA)分子在酸性条件下共热,形成粉红色复合物。该物质在波长532nm有极大吸收峰。可用分光光法进行测定。

1.3.4.1.2.2 仪器与试剂

仪器:可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管。

试剂:0.2M乙酸盐缓冲液 pH3.5

0.2M乙酸溶液    185mL

0.2M乙酸钠溶液  15mL

1mmol/L四乙氧基丙烷(贮备液,4℃保存3个月),临用前用水稀释成40nmol/mL

8.1%十二烷基硫酸钠SDS

0.8%硫代巴比妥酸TBA

0.2M磷酸盐缓冲液 pH7.4

0.2M磷酸氢二钠    1920mL

0.2M 磷酸二氢钾    480mL

1.3.4.1.2.3 实验步骤

1.3.4.1.2.3.1 样品制备

溶血液样品:取血20μL加入0.98mL蒸馏水制成2%溶血液。

1.3.4.1.2.3.2样品测定

 

试剂

空白管

样品管

标准管

2%溶血液*

 

0.2mL

 

40nmol/mL四乙氧基丙烷

 

 

0.2mL

8.1%SDS

0.2mL

0.2mL

0.2mL

0.2M乙酸盐缓冲液 

1.5mL

1.5mL

1.5mL

0.8%TBA

1.5mL

1.5mL

1.5mL

H2O

0.8mL

0.6mL

0.6mL

混匀,避光沸水浴60min,流水冷却,于532nm比色

注:如用试剂盒,可按试剂盒的操作要求进行。

*若用血清,样品管0.15mL,标准管0.15mL

 

1.3.4.1.2.3.3计算

A: 空白管吸光度

B:样品吸光度

F:四乙氧基丙烷吸光度

C:四乙氧基丙烷浓度40nmol/mL

K:稀释倍数

 

1.3.4.2组织中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)含量测定

1.3.4.2.1 原理

     1.3.4.1.2.1

1.3.4.2.2 仪器与试剂

仪器:可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管、组织匀浆器

试剂:见1.3.4.1.2.2

1.3.4.2.3 实验步骤

1.3.4.2.3.1 样品制备

组织匀浆样品:取一定量的所需脏器,生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎,置匀浆器中,加入0.2M磷酸盐缓冲液,以20000r/min匀浆10s,间歇30s,反复进行3次,制成10%组织匀浆(W/V),3000r/min离心510min,取上清液待测。

1.3.4.2.3.2样品测定

 

试剂

空白管

样品管

标准管

10%组织匀浆

 

0.2mL

 

40nmol/mL四乙氧基丙烷

 

 

0.2mL

8.1%SDS

0.2mL

0.2mL

0.2mL

0.2M乙酸盐缓冲液 

1.5mL

1.5mL

1.5mL

0.8%TBA

1.5mL

1.5mL

1.5mL

H2O

0.8mL

0.7mL

0.7mL

混匀,避光沸水浴60min,流水冷却,于532nm比色

注:如用试剂盒,可按试剂盒的操作要求进行

1.3.4.2.3.3计算

A: 空白管吸光度

B:样品管吸光度

F:四乙氧基丙烷吸光度

C:四乙氧基丙烷浓度40nmol/mL

 

K:稀释倍数

1.3.4.3 血清中8-表氢氧-异前列腺素(8-Isoprostane)测定

1.3.4.3.1原理

8-表氢氧-异前列腺素(8-Isoprostane)是体内脂质氧化应激反应稳定而具有特异性的标志物其含量能间接反应机体内自由基的产生而导致组织细胞的脂质过氧化程度。

1.3.4.3.2仪器与试剂

     仪器:酶标仪、生化培养箱、微量振荡器、微量加样器、洗板机

     试剂:8-Isoprostane KIA Kit (酶联免疫试剂盒)

     8-Isoprostane EIA 抗体血清、8-Isoprostane AChE示踪物、8-Isoprostane EIA标准品、EIA缓冲液、洗涤缓冲液、吐温20、鼠抗-IgG抗体、EIA示踪染色剂、EIA抗体血清染色剂、Ellmans试剂

1.3.4.3.3实验步骤

1.3.4.3.3.1样品制备

小鼠眼内眦静脉丛取血,3000r/min离心10min取上清液,用EIA 缓冲液稀释15倍备用。

1.3.4.3.3.2样品测定

按试剂盒说明操作。

8-表氢氧异前列腺素标准孔浓度分别为:500 pg/mL200 pg/mL80 pg/mL32 pg/mL12.8 pg/mL5.1 pg/mL2.0 pg/mL0.8pg/mL

步骤

试剂

空白

TA

NSB

B0

标准/样品

1.加试剂

EIA 缓冲液

-

-

100μL

50μL

-

标准/样品

-

-

-

-

50μL

AChE示踪物

-

-

50μL

50μL

50μL

抗体血清

-

-

-

50μL

50μL

2.培养

用封板膜盖好酶标板,并在4℃避光条件下培养18小时

3.清洗

清洗所有反应孔五次

4.加试剂

AChE示踪物

-

5μL

-

-

-

Ellmans

200μL

200μL

200μL

200μL

200μL

5.培养

用封板膜盖好酶标板,并在常温避光条件下培养45-90分钟

6.读数

在波长412nm处测量各孔吸光度(B0 0.3-1.0 A.U范围)

以标准物的浓度的对数(log)为横坐标,%B/B0为纵坐标绘制标准曲线,亦可将数据转换成logit(B/B0)ln[B/B0/(1-B/B0)]做为纵坐标绘制标准曲线,计算回归方程。将样品的%B/B0值,代入方程式,计算出样品的浓度,再乘以稀释倍数,即为样品中的8-表氢氧异前列腺素浓度。

1.3.5蛋白质氧化产物测定

H2O2O2·ˉ自由基对蛋白质氨基酸侧链的氧化可导致羰基产物的积累。羟自由基也可直接作用于肽链,使肽链断裂,引起蛋白质一级结构的破坏,在断裂处产生羰基。羰基化蛋白极易相互交联、聚集为大分子从而降低或失去原有蛋白质的功能,蛋白质羰基含量可直接反映蛋白质损伤的程度。蛋白质羰基形成是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志,它随着年龄的增长而增加。

1.3.5.1血清中蛋白质羰基测定

1.3.5.1.1原理

被氧化后的蛋白质羰基含量增多,羰基可与24-二硝基苯肼反应生成24-二硝基苯腙,24.二硝基苯腙为红棕色的沉淀,将沉淀用盐酸胍溶解后即可在分光光度计上读取370 nm下的吸光度值,从而测定蛋白质的羰基含量。

1.3.5.1.2仪器与试剂

  仪器:紫外分光光度计、酶标仪、微量加样器、生化培养箱、恒温水浴锅、低温高速离心机、混旋器、2ml离心管。

     试剂:10 mmol/L  24-二硝基苯肼(DNPH)

               99毫克24-二硝基苯肼用50ml 2 mol/L HCL 溶解,4℃避光保存。

           2 mol/L HCL

           200 g/L 三氯乙酸(TCA

           6 mol/L 盐酸胍

           无水乙醇乙酸乙酯混合应用液

               将无水乙醇和乙酸乙酯按照体积比11的比例配置成混合溶液,现用现配。

1.3.5.1.3操作步骤

 

试剂

测定管

对照管

血清(血浆)

0.1ml

0.1ml

10 mmol/L  24-二硝基苯肼

0.4ml

 

2 mol/L HCL

 

0.4ml

涡旋混匀1分钟,37℃准确避光反应30分钟

200 g/L 三氯乙酸

0.5ml

0.5ml

涡旋混匀1分钟,以4℃下,以12000r/min离心10min,弃上清,留沉淀

无水乙醇乙酸乙酯混合应用液

1.0ml

1.0ml

涡旋混匀1分钟,以4℃下,以12000r/min离心10min,弃上清,留沉淀

无水乙醇乙酸乙酯混合应用液

1.0ml

1.0ml

涡旋混匀1分钟,以4℃下,以12000r/min离心10min,弃上清,留沉淀

无水乙醇乙酸乙酯混合应用液

1.0ml

1.0ml

涡旋混匀1分钟,以4℃下,以12000r/min离心10min,弃上清,留沉淀

无水乙醇乙酸乙酯混合应用液

1.0ml

1.0ml

涡旋混匀1分钟,以4℃下,以12000r/min离心10min,弃上清,留沉淀

6 mol/L 盐酸胍

1.25ml

1.25ml

混匀后,37℃准确水浴15分钟

涡旋混匀,将全部沉淀溶解,以12000r/min离心15min,取上清液在370nm处比色,6 mol/L 盐酸胍试剂调零,测定OD值。用双缩脲法测定血清(或血浆)蛋白质含量。

注:如用试剂盒,可按试剂盒的操作要求进行。